افزایش پایداری آنزیم لوسیفراز گونه photinus pyralis در برابر هضم پروتئازها با استفاده از روش جهش زایی هدفدار

آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب (ec; 1.13.12.7 ) اکسیداسیون لوسیفرین را در حضور یون های منیزیم، atp و اکسیژن مولکولی کاتالیز می کند. لوسیفراز آنزیمی تک زیر واحدی (62 kda) و دارای دو دمین n- ترمینال و c- ترمینال می باشد. این آنزیم، به عنوان ژن گزارشگر در in vivo imaging کاربردهای بسیار زیادی دارد. لوسیفراز در مقابل پروتئازها حساس و به سرعت غیر فعال می شود. تیمار این آنزیم با تریپسین نشان داده است که در شش جایگاه k206) ، r213، r218 ،k329، r330 و r337) واقع در دومین n- ترمینال برش داده می شود. چهار جایگاه برش k206) ، r218 ،k329، r330) در بین تمامی لوسیفرازها حفاظت شده می باشند. در این تحقیق اسید آمینه آرژینین213 (حفاظت شده نمی باشد)، به عنوان یک جایگاه جهش مورد توجه قرار گرفت و با متیونین و گلوتامات جایگزین شد. آرژینین 337 به عنوان جایگاه دیگری برای ایجاد جهش انتخاب و جهش یافتهr337q در این ناحیه طراحی گردید. جهش یافته دیگر براساس تاثیر پرولین بر کاهش احتمال برش طراحی گردید، در این حالت گلوتامین 338 (بعد از آرژینین 337) با پرولین جایگزین شد. برای ایجاد جهش از روش جهش زایی هدفدار به روش soe-pcr استفاده گردید. بعد از تخلیص پروتئین های جهش یافته و طبیعی، مطالعات پروتئولیز محدود در حضور تریپسین و کیموتریپسین برای بررسی پایداری جهش-یافته ها در حضور پروتئازها انجام شد. همچنین جهت بررسی تغییرات ساختاری از مطالعات فلورسانس استفاده شد. مطالعات فلورسانس نشان دهنده فشرده تر شدن ساختار پروتئین در اثر جهش های حاصله است که این تغییرات ساختار همراه با افزایش پایداری حرارتی و پایداری پروتئولیتیکی جهش یافته ها می باشد. این افزایش پایداری برای جهش یافته r337q قابل توجه بوده به طوریکه در سلول های یوکاریوتی نیز نسبت به لوسیفراز طبیعی پایدارتر می باشد.